Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Для интеграции генов биосинтеза эктоина из M. marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 был выбран вектор, мини-транспозон pBSL-180. Кассета для интеграции, входящая в состав pBSL-180, содержала конститутивный промотор метанолдегидрогеназы Pmax и ectABC гены. Данный вектор был сконструирован следующим образом. ПЦР-фрагмент, содержащий промоторную область Pmax, амплифицировали с плазмиды pCM-160, используя праймеры PmaxF-PmaxR, и клонировали по сайтам EcoRI и BamHI в pBSL-180 с образованием вектора pBSL/Pmax. ДНК-фрагмент, кодирующий гены биосинтеза эктоина ectABC, был амплифицирован из M. marina с использованием праймеров Ect-operC(hal) и Ect-operN(hal). ПЦР-фрагмент клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и HindIII в плазмиду pBSL/Pmax c образованием pBSL/Pmax/ectABC размером около 9 т.п.н. ( Рис 14)

Рис. 14. Схема клонирования генов биосинтеза эктоина(ectABC) из M. marina под промотором метанолдегидрогеназы(Pmax) в мини-транспозон pBSL-180.

Конструкцию pBSL/Pmax/ectABC трансформировали в клетки E. coli S-17(גpir). Полученные трансформанты E. coli использовали для конъюгации в дикий штамм M. extorquens AM1. Трансформанты M. extorquens, содержащие плазмиду pBSL180/Pmax/ectABC, выращивали на агаризованой минеральной среде К с метанолом и канамицином.

Наличие интегрированной кассеты Pmax/ectABC в хромосоме M. extorquens AM1 оценивали ПЦР с праймерами PmaxF и ectArev на Pmax и ectA (Рис 15).

M

~700 п.н.

Рис.15 Электрофорез ПЦР продуктов генов Pmax и ectA с использованием праймеров:

PmaxF и ectARev, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Трансформанты M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) выращивали на среде К с канамицином, клетки собирали центрифугированием. Экстракцию эктоина из клеток метанолом проводили в течение 2 ч. В полученных метанольных экстрактах количество эктоина анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе высокого давления Prominence, оснащенным детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония).

В полученных трансформантах M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) был обнаружен эктоин в концентрации 75 мкг на 100 мг сухих клеток (Рис. 16с), что свидетельствует об экспрессии генов ectABC с промотора Pmax.

А)

Б)

С)

Рис. 16 Анализ накопления эктоина используя метод ВЭЖХ: а) контроль эктоина (“Sigma”), б) дикий штамм M. extorquens AM1, с) рекомбинантный штамм M. extorquens AM1.


Также смотрите:

Закон единообразия гибридов первого поколения (первый закон Менделя)
Данный закон утверждает, что скрещивание особей, различающихся по данному признаку (гомозиготных по разным аллелям), дает генетически однородное потомство (поколение F 1), все особи которого гетерозиготны. Все гибриды F 1 могут иметь при этом либо фенотип одного из ро ...

Синтетическая теория эволюции
Одним из направлений развития дарвинизма является синтетическая теория эволюции, созданная в 30-40-х гг. XX в. (Э. Майр называет сроками создания синтетической теории 1936-1947 гг.). в ней объединены на основе дарвинизма современные биологические концепции: генетико-э ...

Выражение эмоций. Мимика
Многие считают, что дельфинам не присуща мимика, однако, это не так. Каждый, кто подолгу наблюдал за дельфинами, не только безошибочно узнает их по «физиономиям», но часто «по выражению их лиц» способен определить «настроение» каждого зверя. Хотя их морды действительн ...